Nel 1723 sale al trono di Toscana Gian Gastone, che non avrà figli. Alla sua morte, nel 1737 la dinastia dei Medici sarà sostituita da quella degli Asburgo-Lorena, fermo restando il fatto che, secondo il volere di Anna Maria Ludovica (l'Elettrice Palatina, ultima discendente dei Medici) le collezioni familiari, cioè il patrimonio artistico e culturale di Firenze deve rimanere legato alla città “per ornamento dello Stato, e per utilità del pubblico, e per attirare la curiosità dei forestieri”.
A Ludovica, che muore nel 1743, è dovuta anche l'ultima costruzione medicea: il campanile della chiesa di San Lorenzo, costruito da Ferdinando Ruggieri nel 1740, in età ormai lorenese.
Nel 1737 è granduca di Toscana Francesco Stefano di Lorena, il marito dal 1736 di Maria Teresa d'Asburgo che darà inizio alla dinastia degli Asburgo-Lorena: assume il nome di Francesco II di Toscana ed entra a Firenze nel 1739 dall'Arco di Trionfo (Piazza della Libertà) costruito per l’occasione.
Nel 1752 la Biblioteca Marucelliana è aperta al pubblico.
Nel 1753, durante l'Illuminismo, è fondata l'Accademia dei Georgofili, per promuovere studi di agricoltura; in quell'anno il veneziano riformatore della commedia, Carlo Goldoni, che ha appena scritto La Locandiera, è a Firenze.
Nel 1765 sale al trono il secondo granduca lorenese Pietro Leopoldo, che apre al pubblico il parco delle Cascine (1765) e il Giardino di Bòboli, costruendovi quindi opere come il Kaffeehaus, la Palazzina della Meridiana e la Limonaia. Il granduca realizza molte riforme, tra cui il libero commercio del grano e l’abolizione della pena di morte (30 novembre 1786) in Toscana, primo stato al mondo.
Nel 1775 Zanobi Del Rosso unendo due facciate di chiese dei padri Filippini realizza il complesso di San Firenze, concludendo in stile barocco scenografico una lunga vicenda progettuale.
Nell'ambito della cosiddetta “architettura di servizi”, Pietro Leopoldo costruisce edifici con funzione sociale: le Scuole Leopoldine (1780) in Piazza S. Maria Novella, l'Ospedale di Bonifacio (1787) in Via San Gallo, la sperimentale Palazzina delle Cascine (dal 1787) oggi facoltà di Agraria.
Nel 1783 è demolita la pericolante chiesa di San Pier Maggiore, originaria del secolo XI, con portico (del 1638), del quale restano le tre arcate nella piazza attuale.
Nel 1784 viene inaugurata l'Accademia delle Belle Arti (Via Ricasoli), importante istituto di istruzione artistica che nella sua Galleria ospiterà opere d'arte (inizialmente come modelli per gli allievi), e successivamente le sculture michelangiolesche, tra cui l'originale del David, qui trasportato nel 1873.
Nel 1790 il granduca di Toscana Pietro Leopoldo diviene imperatore del Sacro Romano Impero a Vienna, mentre a Firenze gli succede il figlio Ferdinando III, il cui regno sarà però interrotto per 15 anni dalle guerre napoleoniche (1799-1814).