Nel 1504 viene collocata davanti a Palazzo Vecchio la Statua del David di Michelangelo, come simbolo della libertà cittadina.
Nel 1512 tornano in città i Medici, con il cardinale Giovanni, figlio di Lorenzo il Magnifico, che nel 1513 è eletto papa col nome di Leone X: dovrà affrontare la ribellione e la “protesta” di Martin Lutero in Germania, ma da Roma controlla Firenze attraverso il nipote Lorenzo (il duca d’Urbino) e il fratello Giuliano (il duca di Nemours), entrambi rappresentati da statue di Michelangelo (rispettivamente “il Pensiero” e “l’Azione”), dal 1520 nella Sacrestia Nuova di San Lorenzo. Inoltre il papa mediceo nomina cardinale il cugino Giulio, figlio di suo zio Giuliano il Bello, colui che diventerà a sua volta papa nel 1523 col nome di Clemente VII: quest'ultimo dovrà affrontare il saccheggio di Roma, dopo il tentativo di fermare i Lanzichenecchi imperiali da parte di Giovanni dalle Bande Nere, che è ferito a morte nel 1526.
Il popolo fiorentino non gradisce il dispotismo mediceo e insorge, approfittando del Sacco di Roma nel 1527, ricostituendo le magistrature repubblicane.
Dopo il Rinascimento e il suo studio della natura, nel Cinquecento prevale negli artisti un'attenzione allo stile e all'eleganza formale dei modelli precedenti (sia della tradizione antica, sia del secolo precedente) da imitare: Andrea Del Sarto arriva ad una pittura così perfetta da essere considerata “senza errori”, realizzata nel Chiostro dei Voti (alla Santissima Annunziata: scene con la Vita di Maria, 1514), nel ciclo del Chiostro dello Scalzo (Vita di San Giovanni Battista, 1509-1526, Via Cavour 69) e nel Cenacolo del monastero di San Salvi (1527). I suoi allievi, Pontormo e Rosso Fiorentino accentuano il formalismo aggiungendovi le inquietudini e tensioni del nuovo movimento del Manierismo, virtuosistico e intellettualistico.
Fuori delle mura trecentesche, in previsione del prossimo assedio, vengono distrutti vecchi monasteri (delle monache di Faenza, e di San Gallo, presso le Porte omonime), per non offrire riparo alle truppe nemiche; viene invece risparmiato il monastero di San Salvi, per conservare il recente affresco di Andrea Del Sarto.
Nel 1530, durante il lungo assedio da parte dell'esercito imperiale, viene giocata in Piazza Santa Croce viene giocata una partita di calcio “in livrea”, nonostante i colpi di cannone delle postazioni imperiali. Purtroppo però, dopo un'eroica resistenza a cui collaborarono Michelangelo (come costruttore di fortificazioni), e Francesco Ferrucci (come condottiero), la seconda repubblica fiorentina deve capitolare: diventerà uno stato dinastico, con a capo Alessandro dei Medici (figlio naturale di Lorenzo duca d’Urbino), che avrà il titolo di duca di Firenze (1532): sua sorella Caterina dei Medici sposa nel 1533 Enrico, duca d’Orleans, il futuro Enrico II re di Francia.
Nel 1534 il duca Alessandro fa costruire ad Antonio da Sangallo, su pianta pentagonale, la Fortezza da Basso (o Forte di San Giovanni Battista), un’architettura militare che ingloba la precedente Porta a Faenza, con funzione di protezione della città lungo le mura trecentesche, ma anche dalla città, in caso di sollevazioni popolari; la copertura della terrazza fortificata è del 1649.
Dopo l'uccisione del duca Alessandro, ultimo erede del ramo mediceo di Cosimo il Vecchio, il potere è assegnato nel 1537 al giovane Cosimo I, figlio di Maria Salviati e di Giovanni dalle Bande Nere, del ramo “popolano” dei Medici. Dopo aver sconfitto i fuorusciti antimedicei nella battaglia di Montemurlo nel 1537, sarà il primo di 7 granduchi medicei, tra cui i suoi figli Francesco I e Ferdinando I, avuti dalla moglie Eleonora di Toledo.
Nel 1539 Cosimo I sposa Eleonora di Toledo, che dal 1540 utilizza con la sua corte un ambiente della chiesa di S. Maria Novella per le funzioni religiose: il Cappellone degli Spagnoli. Nel 1549 la coppia regnante compra Palazzo Pitti (iniziato dal banchiere nel 1458), facendone la residenza granducale, con zona verde retrostante, progettata dal 1550 dal Tribolo (il Giardino di Bòboli), e con cortile dell’Ammannati (dal 1558).
Nel 1551, dove nel Medioevo si svolgeva un mercato, e dove sostava il carroccio comunale prima delle battaglie, sorge la Loggia del Mercato Nuovo, detta anche Loggia del Porcellino, da quando (1612) Pietro Tacca vi inserisce una fontana con un animale in bronzo, che in realtà è un cinghiale.
Nella Loggia della Signoria (o Loggia dei Lanzi, o dell'Orcagna) viene collocata nel 1554 la statua del Perseo di Benvenuto Cellini.
Nel 1555 i fiorentini dopo un lungo assedio conquistano Siena, che entra a far parte del ducato, insieme a Pisa, che era stata presa definitivamente nel 1509.
Nel 1560 Giorgio Vasari inizia la costruzione degli Uffizi come fabbrica per le 13 Magistrature dell'apparato statale del granduca Cosimo I, per il quale realizza anche (1565) il Corridoio Vasariano, collegamento tra la sede del potere (Palazzo Vecchio) e la residenza granducale (Palazzo Pitti).
Il Vasari fa anche diventare il grande salone di Palazzo Vecchio un ambiente di rappresentanza, per il quale affresca nel 1565 l’enorme soffitto con 39 riquadri, affiancati alle pareti con scene sulle recenti conquiste di Pisa e Siena; nel 1567 costruisce nel Mercato Vecchio la Loggia del Pesce (oggi in Piazza dei Ciompi, dopo gli sventramento ottocenteschi).
Nel 1569, anno in cui il papa Pio V attribuisce a Cosimo I il titolo di granduca di Toscana, Bartolomeo Ammannati compie la ricostruzione del Ponte a Santa Trìnita, su tre eleganti e snelle arcate: nel 1608 sarà fiancheggiato dalle statue delle 4 Stagioni.
Dal 1570 Francesco I, che ha sposato Giovanna d’Austria nel 1565, si fa costruire in Palazzo Vecchio lo “Studiolo”, ambiente prezioso e raccolto in cui, in mezzo a dipinti manieristi e statuette in bronzo, il principe poteva dedicarsi ai suoi studi di scienze e di alchimia.
Nel 1583 viene fondata l’Accademia della Crusca, che pubblicherà nel 1612 la prima edizione del suo Vocabolario, il primo in assoluto di una lingua nazionale.
Il gruppo scultoreo che rappresenta il Ratto delle Sabine è scolpito nel 1583 dal Giambologna e posto sotto la Loggia della Signoria: è considerato la prima scultura moderna, nel senso che obbliga ad una visuale multipla, perfetta da ogni angolazione. Dello stesso Giambologna è la statua equestre di Cosimo I (1594) in Piazza della Signoria.
Il terzo granduca mediceo Ferdinando I, succeduto al fratello Francesco I (morto nel 1587 a Poggio a Caiano contemporaneamente alla seconda moglie Bianca Cappello, sposata nel 1578), si avvicina politicamente alla Francia, invece che alla tradizionale alleata spagnola: sposerà infatti (1589) Cristina di Lorena, per la quale allestirà una battaglia navale nel cortile di Palazzo Pitti.
Nel 1588 è fondato da Ferdinando I l'Opificio delle Pietre Dure, laboratorio specializzato nella produzione di opere d’arte che utilizzano pietre rare e pregiate: tavoli, mobili, vasi, quadri, statue, reliquiari, ma anche per la decorazione di monumenti quali la Cappella dei Principi.
Nel 1590 Bernardo Buontalenti costruisce per Fernando I il Forte di Belvedere, completando il sistema difensivo contro attacchi interni ed esterni.