Ha sede nel grande Palazzo della Crocetta, costruito nel 1620 da Giulio Parigi per la granduchessa Maria Maddalena d'Austria
Il Museo accoglie esposizioni in vari settori: Museo Egizio, Antiquarium Etrusco-Greco-Romano, raccolta glittica.
Tra le opere più importanti: sarcofagi, sculture, bassorilievi, mummie, papiri, stele dell'antico Egitto; oggetti etruschi come urne cinerarie (soprattutto in alabastro), sarcofagi in pietra e in marmo, la Chimera, l'Arringatore, la Minerva; sculture in marmo (i “kùroi” arcaici greci); scultura in bronzo greca (l'Idolino di Pesaro) e romana; vasi attici greci a figure nere (il cratere François) e a figure rosse.
Nel Giardino, lungo Via della Colonna, si trova la Sezione Topografica dell'Etruria: vi furono collocati monumenti archeologici, qui ricostruiti, realizzando un un'esposizione all'aperto, fra strutture etrusche in mezzo alle piante. Tra le Tombe più importanti sono la Tomba Inghirami, con 53 urne di alabastro, la Tomba del Diavolino (da Vetulonia, con un corridoio di accesso), e la Tomba di Casale Marittimo (con copertura a falsa cupola, e segnacolo funerario al culmine del tumulo di terra).
Una curiosità: esiste un corridoio mediceo, che collega il palazzo e la chiesa della Santissima Annunziata, passando sopra la Via Gino Capponi: questo corridoio è stato utilizzato per ospitare la Sezione glittica, cioè i cammei romani e rinascimentali.
Ma ciò che qui interessa sono dei ruderi romani collocati nel cosiddetto Cortile dei Fiorentini, subito dopo l'ingresso di Via della Colonna.
Si tratta della base della Porta Settentrionale appartenente alle mura romane del I secolo a. C., di mosaici pavimentali del II secolo d. C., e di parti di una domus riemersa in Piazza San Giovanni (accanto al Battistero), di decorazioni architettoniche del Tempio Capitolino (zona dell'attuale Piazza della Repubblica), e del Tempio di Iside (scoperto sotto la chiesa di San Firenze).
Spesso questi frammenti sono stati assemblati in strani e discutibili tempietti ad edicola, accostando i pezzi uno sull'altro, sotto una tettoia per ripararli dalle intemperie.